免疫熒光定量分析儀

免疫熒光定量分析儀-用于人體血液和尿液中的各種分析（CRP、PCT、NT-proBNP、cTnI等)快速準(zhǔn)確地分析含量。大功率光源LED燈珠采用窄帶干涉濾光器濾光激發(fā)光和熒光，內(nèi)置光電轉(zhuǎn)換芯片OPT101檢測(cè)熒光強(qiáng)度。由立邁勝一體化步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，皮帶驅(qū)動(dòng)驅(qū)動(dòng)雙排滾珠寬體滑塊在單個(gè)精密直線導(dǎo)軌上滑動(dòng)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)樣品的掃描檢測(cè)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)儀器的比較試驗(yàn)，結(jié)果表明，在小型化、快速性和低成本的基礎(chǔ)上，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確床應(yīng)用的要求。

免疫熒光分析技術(shù)是一種新開(kāi)發(fā)的精密免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法和金標(biāo)法相比，免疫熒光分析技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作方便，無(wú)放射性物質(zhì)，具有無(wú)放射性、標(biāo)記穩(wěn)定、長(zhǎng)期保存方便、試驗(yàn)重復(fù)性好、分析速度快、樣品用量少、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[1]。熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與物質(zhì)數(shù)量成正比，可以通過(guò)測(cè)量熒光光譜和熒光強(qiáng)度來(lái)定性或定量分析物質(zhì)。免疫熒光分析技術(shù)是微生物、病毒抗原或抗體檢測(cè)、激素檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、毒品檢測(cè)中常用的快速分析技術(shù) 、 、 、 其他檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 免疫熒光定量檢測(cè)原理

特殊的熒光抗體首先固定在硝酸纖維素膜的某個(gè)區(qū)域。當(dāng)干燥的硝酸纖維素一端滴入樣品時(shí)，由于毛細(xì)管的作用，樣品將沿著膜向前移動(dòng)。當(dāng)移動(dòng)到固定的抗體區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原與熒光體特異性結(jié)合。隨著進(jìn)一步的分析，用這種抗原的另一種抗體捕捉復(fù)合物，多余的熒光抗體用第二種抗體捕捉。兩次捕獲的位置分別稱為質(zhì)量控制線（C線)和檢測(cè)線（T線）。當(dāng)光源照射到檢測(cè)卡上時(shí)，質(zhì)量控制線和檢測(cè)線分別刺激不同強(qiáng)度的熒光。光電轉(zhuǎn)換器接收不同強(qiáng)度的熒光，產(chǎn)生不同大小的電信號(hào)。電信號(hào)的強(qiáng)度反映了待檢測(cè)對(duì)象的濃度，從而實(shí)現(xiàn)了特定的免疫診斷。

2 設(shè)計(jì)免疫熒光定量分析儀系統(tǒng)

免疫熒光定量分析儀主要由光學(xué)、硬件電路和系統(tǒng)軟件組成。光學(xué)部分是熒光定量分析儀的核心部分，用于激發(fā)熒光，而硬件電路部分和系統(tǒng)軟件部分用于檢測(cè)和控制整個(gè)儀器的正常運(yùn)行。

2.1 光學(xué)設(shè)計(jì)

如圖1所示，光學(xué)部分由光源發(fā)射光路和熒光檢測(cè)光路組成。

光源發(fā)射光路由LED由光源、凸透鏡1、濾光片1和凸透鏡2組成。LED光源的光軸與凸透鏡1、濾光片1以及凸透鏡2的光軸在一條線上。光源為綠色，中心波長(zhǎng)為580 nm)高亮度LED光源，LED位于發(fā)射光路凸透鏡1的焦點(diǎn)，使光源發(fā)出的光通過(guò)凸透鏡1變成平行光，濾光片1采用中心波長(zhǎng)580 nm帶寬為30 nm窄帶干涉濾光片，平行光通過(guò)濾光片1，進(jìn)入射光565 nm～595 nm過(guò)濾掉范圍以外的光，出射光為窄帶光(565 nm～595 nm)，凸透鏡2后，聚焦在樣品上，激發(fā)熒光，熒光波長(zhǎng)為610 nm。

熒光檢測(cè)光路由凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4和光電轉(zhuǎn)換器組成。光電轉(zhuǎn)換器與凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4的光軸在一條線上。熒光檢測(cè)光路光軸和發(fā)射光路光軸45°激發(fā)光對(duì)熒光信號(hào)檢測(cè)的影響較小化。熒光檢測(cè)光路光軸與發(fā)射光路光軸的交點(diǎn)在試紙上，交點(diǎn)為凸透鏡2和凸透鏡3的焦點(diǎn)。濾光中心波長(zhǎng)61 nm，帶寬為15 nm窄帶干涉濾光片。激發(fā)的熒光被凸透鏡3收集成平行光。平行光通過(guò)濾光片2后，濾光片將過(guò)濾掉原來(lái)的少量激發(fā)光，只有610 nm通過(guò)[2-3]左右熒光信號(hào)。聚焦在熒光檢測(cè)模塊的光電轉(zhuǎn)換器上，通過(guò)濾光片后的光被凸透鏡4收集，實(shí)現(xiàn)光信號(hào)轉(zhuǎn)換到電信號(hào)。

2.2 硬件電路部分設(shè)計(jì)系統(tǒng)硬件電路

系統(tǒng)硬件電路的結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。儀器的測(cè)量原理是通過(guò)發(fā)光控制模塊將待檢測(cè)樣本驅(qū)動(dòng)到檢測(cè)器檢測(cè)口上方LED發(fā)光強(qiáng)度符合測(cè)量強(qiáng)度要求，光電傳感器檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，放大濾波后輸出信號(hào)進(jìn)入ADS1252將數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換為處理器[4]。

圖2中檢測(cè)器框中顯示的部分包括上述2.1描述的光學(xué)部分和部分硬件電路共同包裝在探測(cè)器中，提高了檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性和抗干擾性。探測(cè)器的硬件電路由發(fā)光控制模塊和熒光檢測(cè)模塊組成。

為保證光源的穩(wěn)定性，發(fā)光控制模塊采用恒流源驅(qū)動(dòng)模式，可有效保證光源發(fā)光強(qiáng)度的恒定。對(duì)于某些樣品，照射光源不應(yīng)太強(qiáng)。因此，恒流源采用程序控制調(diào)節(jié)的恒流源，可通過(guò)輸入不同的數(shù)字值進(jìn)行控制LED發(fā)光強(qiáng)度LED程序可以控制驅(qū)動(dòng)電流的大小。

光電轉(zhuǎn)換器選用內(nèi)置光電轉(zhuǎn)換芯片OPT101。熒光檢測(cè)模塊包括光電轉(zhuǎn)換、信號(hào)放大濾波、電壓偏置、模/數(shù)轉(zhuǎn)換等。其中，信號(hào)放大采用程控放大，模/數(shù)轉(zhuǎn)換采用24位A/D轉(zhuǎn)換芯片ADS1252可以保證足夠的轉(zhuǎn)換精度和較大的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。數(shù)字電信號(hào)傳輸給控制器，比模擬信號(hào)具有更強(qiáng)的抗干擾性和準(zhǔn)確性，大大提高了系統(tǒng)的檢測(cè)精度。

2.3 系統(tǒng)軟件部分設(shè)置

用C語(yǔ)言編寫(xiě)系統(tǒng)軟件，如圖3所示。系統(tǒng)初始化主要完成系統(tǒng)各外圍模塊的配置和歷史設(shè)置的讀取和配置。待系統(tǒng)初始化完成后，控制電機(jī)帶動(dòng)樣品卡卡槽出倉(cāng)，并在顯示屏上提示用戶插入檢測(cè)樣品卡。系統(tǒng)循環(huán)檢測(cè)樣品卡是否插入卡槽。當(dāng)檢測(cè)到樣品卡插入時(shí)，系統(tǒng)打開(kāi)二維碼掃描槍，控制電機(jī)驅(qū)動(dòng)樣品卡移動(dòng)到掃描槍讀取二維碼。二維碼包括檢測(cè)項(xiàng)目、產(chǎn)品批號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息。判斷二維碼信息有效后，系統(tǒng)打開(kāi)LED并根據(jù)二維碼相關(guān)信息進(jìn)行調(diào)整LED亮度控制電機(jī)驅(qū)動(dòng)待檢測(cè)樣本移動(dòng)到檢測(cè)器上方進(jìn)行檢測(cè)。收集到的數(shù)據(jù)將是txt保存文件的形式SD在卡中，通過(guò)一定的算法計(jì)算出T線和C線對(duì)應(yīng)峰值的面積的濃度，在顯示屏上顯示較終熒光強(qiáng)度曲線和樣品的濃度檢測(cè)結(jié)果，并自動(dòng)存儲(chǔ)和打印檢測(cè)信息[5]。

3 結(jié)果及分析

本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀可以測(cè)量血液和尿液中各種物質(zhì)的濃度NT-proBNP（N末端腦鈉肽前體的濃度測(cè)量是對(duì)儀器運(yùn)行效果的分析。NT-proBNP一種由心臟分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素 ，已被證明是心力衰竭患者臨床診斷、治療和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[6]。

3.1 采集熒光信號(hào)

將樣品卡插到儀器的卡槽內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)得到熒光強(qiáng)度曲線如圖4所示。圖中橫坐標(biāo)代表數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)，縱坐標(biāo)代表光電轉(zhuǎn)換器輸出的電壓值，單位為mV。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)直線擬合

獲得樣品熒光強(qiáng)度曲線后，T線與C線對(duì)應(yīng)曲線峰值的面積可以通過(guò)高斯擬合計(jì)算，T線與C線對(duì)應(yīng)峰值的面積可以計(jì)算樣品的濃度。這需要一組標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證產(chǎn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證產(chǎn)品的測(cè)量結(jié)果，建立一定的數(shù)學(xué)模型，計(jì)算T線與C線對(duì)應(yīng)峰值的面積與樣品濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

樣品濃度與T線對(duì)應(yīng)峰值的面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證產(chǎn)品獲得(使用)AT表示)與C線對(duì)應(yīng)峰值的面積(使用AC表示）之比AT/AC如表1所示。

較小二乘法通過(guò)表1中的對(duì)應(yīng)關(guān)系獲得的樣品濃度和AT/AC如圖5所示，數(shù)學(xué)量化關(guān)系。

從圖5乘法擬合直線的表達(dá)式如圖1所示：

y=9 912.156x-84.742 8(1)

直線擬合相關(guān)系數(shù)R=0.999 92.說(shuō)明這六種標(biāo)準(zhǔn)濃度校準(zhǔn)產(chǎn)品的濃度和濃度AT/AC線性關(guān)系很好。

3.3 系統(tǒng)測(cè)量誤差分析

選擇一組相同批次的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品，根據(jù)1測(cè)量樣品濃度，分析系統(tǒng)的檢測(cè)誤差，測(cè)量結(jié)果如表2所示

從表2的測(cè)量結(jié)果可以看出，標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品的測(cè)量誤差在于±滿足8%以內(nèi)實(shí)際使用要求。以下是一組醫(yī)院患者血液樣品，以進(jìn)口銳普智能熒光干定量分析儀為標(biāo)準(zhǔn)儀器進(jìn)行對(duì)比測(cè)量。每個(gè)病例取75 L將樣品緩沖液中加入病人的血樣，將溶液充分混合，然后取75 ?將樣品滴加入樣品卡的孔，等待15 min將樣品卡插入儀器卡槽后得到的測(cè)量結(jié)果如表3所示.

從表3的對(duì)比測(cè)量結(jié)果可以看出，本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀的測(cè)量誤差在于±能滿足臨床應(yīng)用要求的8%以內(nèi)。

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了免疫熒光定量分析儀，詳細(xì)介紹了儀器的光學(xué)、硬件電路和系統(tǒng)軟件。從多個(gè)角度分析儀器的運(yùn)行結(jié)果。從結(jié)果可以看出，儀器可以擬合出線性好的標(biāo)準(zhǔn)直線。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證產(chǎn)品的測(cè)量試驗(yàn)和與標(biāo)準(zhǔn)儀器的比較試驗(yàn)，表明儀器可以在小型化、快速性的基礎(chǔ)上控制測(cè)量誤差±能滿足臨床應(yīng)用要求的8%以內(nèi)。